La conoscenza approfondita delle caratteristiche biologiche ed ecologiche del virus BVD è necessaria per progettare un programma efficace di gestione sanitaria che si adatti alle caratteristiche uniche e peculiari di ciascun allevamento.

Tutti i sistemi di controllo della BVD si basano su due pilastri che sono l’evidenziazione (ed eliminazione) dei bovini persistentemente infetti e la protezione della mandria dalla circolazione virale.

In questo articolo illustreremo le varie modalità di rilevamento dell’infezione da virus BVD.

Modalità di diagnosi

La diagnosi della BVD può essere effettuata utilizzando diverse modalità, sia dirette che indirette:

  • Diagnosi diretta. Questo tipo di indagine prevede il rilevamento del virus intero, o di parti di esso, nel campione biologico. Le principali metodiche di diagnosi diretta sono:
    1. L’identificazione del materiale genetico del virus nei tessuti e fluidi corporei mediante le tecniche di biologia molecolare, come la reazione a catena della polimerasi (PCR) o la trascrizione inversa seguita dalla PCR (RT-PCR).
    2. L’isolamento del virus da campioni biologici prelevati dall’organismo. Il virus viene isolato in colture cellulari sensibili.
    3. L’immunofluorescenza. Questa tecnica impiega anticorpi specifici per il virus BVD che vengono marcati con sostanze fluorescenti per rilevare la presenza del virus nelle cellule di un campione istologico.
    4. Microscopia elettronica. Il microscopio elettronico può consentire l’osservazione diretta del virus BVD nelle cellule infettate o nei fluidi contaminati.
  • Diagnosi Indiretta. Questo tipo di indagine prevede di mettere in evidenza i segni dell’interazione tra il virus BVD e l’organismo animale. Le principali metodiche di diagnosi indiretta sono:
    1. Sierologia: l’analisi del siero ematico per la ricerca di anticorpi specifici contro il virus BVD è uno dei metodi più comuni per la diagnosi indiretta della malattia. La metodica di laboratorio più utilizzata è l’ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay).
    2. Test di sieroneutralizzazione (SN) virale: questo test valuta la capacità del siero sanguigno di neutralizzare il virus BVD, fornendo un’indicazione sulla presenza di anticorpi neutralizzanti e quindi protettivi.
    3. Esame istologico: l’esame dei tessuti prelevati da animali in vivo o morti può rivelare le lesioni istologiche caratteristiche della BVD e confermare la diagnosi.

I metodi diagnostici maggiormente utilizzati nella pratica buiatrica sono:

  • L’identificazione del materiale genetico del virus nei tessuti e fluidi corporei mediante le tecniche di biologia molecolare (PCR e RT-PCR) come metodica di indagine diretta.
  • La sierologia per la messa in evidenza delle immunoglobuline (anticorpi) contro il virus BVD (ELISA e SN).
  • L’esame istologico viene poco utilizzato nella pratica ma assume una straordinaria importanza soprattutto per confermare l’infezione da BVD come causa di aborto. La presenza di un agente abortigeno nei tessuti fetali non è necessariamente imputabile come causa dell’aborto ma quando si mettono in evidenza le lesioni a livello istologico il sospetto diventa più che fondato.

La reazione a catena della polimerasi (PCR) e la reazione a catena della polimerasi con trascrizione inversa (RT-PCR) sono delle tecniche di biologia molecolare ampiamente utilizzate per identificare il materiale genetico dei virus nei campioni biologici e rappresentano un metodo di indagine estremamente sensibile e specifico per la diagnosi diretta della BVD.

  1. Il campione biologico prelevato dall’animale, che può essere sangue, tessuti, liquidi corporei o campioni di secrezioni, viene sottoposto a un processo di estrazione per ottenere il materiale genetico virale presente nel campione. Per il virus BVD, che è un virus a RNA, il materiale genetico target è l’RNA. Una matrice biologica particolarmente interessante è rappresentata dal campione di cute e cartilagine auricolare (ear-notch) prelevato in concomitanza con l’applicazione della marca auricolare.
  2. Trascrizione inversa: poiché il virus BVD ha un genoma a RNA, per utilizzare la PCR è necessario prima convertire l’RNA virale in cDNA. Questo viene ottenuto tramite un enzima chiamato trascrittasi inversa, che sintetizza una copia di DNA complementare (cDNA) del materiale genetico virale a partire dal suo RNA.
  3. Amplificazione del materiale genetico: utilizzando specifici primers (corti frammenti di DNA complementari al materiale genetico del virus BVD), la PCR permette di amplificare in modo esponenziale specifiche sequenze di RNA virale presenti nel campione. Questo processo produce milioni di copie di DNA complementare (cDNA) del virus, rendendo possibile la rilevazione del virus anche in campioni con basse concentrazioni virali.

La RT-PCR seguita dalla PCR sono metodi altamente sensibili e specifici, che consentono di rilevare il virus BVD anche nelle prime fasi dell’infezione, quando la replicazione virale potrebbe non essere ancora evidenziata dai test diagnostici tradizionali. Queste tecniche sono particolarmente utili per identificare animali portatori asintomatici del virus BVD, che possono essere fonte di infezione per gli altri bovini della mandria e, di norma, la loro attendibilità non è influenzata dalla variabilità genetica. È un esame strategico per individuare i bovini persistentemente infetti oppure le infezioni allo stadio iniziale, quando abbiamo la viremia ma il sistema immunitario specifico non ha ancora prodotto immunoglobuline (anticorpi).

Per gli allevamenti di vacche da latte la RT-PCR può essere effettuata, a scopo di screening, anche sul latte di massa.

ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) è il test sierologico più comune ed è basato sulla capacità degli anticorpi presenti nel siero di legarsi specificamente alle proteine del virus BVD. Il siero da analizzare viene messo all’interno di pozzetti in cui è presente l’antigene di riferimento adsorbito su fase solida. Gli anticorpi specifici, se presenti nel siero in esame, si legano all’antigene formando un immunocomplesso. Viene quindi aggiunta una soluzione contenente anticorpi anti-immunoglobulina di specie marcata con perossidasi. Si aggiunge quindi un substrato che reagisce con l’ulteriore immunocomplesso formatosi e la miscela assume una colorazione specifica. Attraverso uno spettrofotometro si legge l’intensità della reazione colorimetrica che dipende dalla quantità di anticorpi presenti nel siero. Questo è un test che assume importanza strategica nel momento in cui occorra avere un quadro generale della condizione immunitaria di una determinata popolazione bovina.

I limiti principali dell’indagine sierologica sono:

  • Gli anticorpi compaiono nel sangue dopo diversi giorni dall’infezione e restituiscono come unica informazione che c’è stato il contatto tra virus e organismo. Non è possibile sapere quando sia avvenuto il contatto.
  • È impossibile riconoscere una sieropositività derivante dall’infezione con virus selvaggio e differenziarla da quella derivante da virus vaccinale, almeno per quanto riguarda l’utilizzo di vaccini vivi attenuati.

La sieroneutralizzazione (SN) è un test altamente specifico ed è utilizzato per misurare la quantità di anticorpi neutralizzanti presenti nel siero di un animale. Nel test un substrato cellulare viene messo a contatto con il virus, a titolo noto e il siero in esame. Gli eventuali anticorpi neutralizzanti presenti non permettono al virus di infettare le cellule e di provocare i danni cellulari (effetto citopatico). In caso di presenza di anticorpi neutralizzanti nel siero in esame il virus viene neutralizzato dagli stessi e quindi le cellule non vengono infettate (assenza di effetto citopatico).

Tale metodica permette anche una titolazione della quantità di anticorpi neutralizzanti che si basano su una diluizione crescente del siero fino a non impedire più che il virus provochi l’effetto citopatico. La sieroneutralizzazione restituisce informazioni preziose circa la capacità da parte del bovino di fronteggiare un’infezione da virus selvaggio poiché ad alti titoli anticorpali generalmente corrisponde una maggiore protezione.

Ci sono alcuni segnali che, più di altri, permettono di sospettare la presenza del virus BVD in allevamento e impongono l’attuazione di un piano per l’identificazione diagnostica:

  • Quando sono evidenziabili infecondità o infertilità, diarree acute negli adulti e diarree neonatali atipiche, per esempio resistenti ai trattamenti classici sono segni d’allarme minori. In questo caso è sufficiente uno screening sierologico semplice, su animali non vaccinati, con lo scopo si evidenziare una circolazione virale relativamente recente.
  • Quando sono riportati casi di sindrome emorragica, un cospicuo numero di aborti in breve tempo e la nascita di vitelli deboli o affetti da anomalie congenite, questi sono considerati segni d’allarme principali e giustificano la ricerca e l’eliminazione sistematica dei soggetti persistentemente infetti.
  • Anche un solo caso di malattia delle mucose è considerato un segno certo di circolazione virale per cui si impone la ricerca e l’eliminazione sistematica dei soggetti persistentemente infetti.

Nel prossimo articolo approfondiremo le caratteristiche del secondo pilastro dei sistemi di controllo della BVD che è rappresentato dalla vaccinazione insieme all’adozione di un rigido piano di biosicurezza.

 

Su questo argomento leggi anche “La Diarrea Virale Bovina (BVD): eziopatogenesi” e “La Diarrea Virale Bovina (BVD): quadro clinico“.